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大鼠纖維母細胞;1/EJ 1-1復蘇操作流程

時間:2021/7/13閱讀:211
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大鼠纖維母細胞;1/EJ 1-1復蘇操作流程:
 

1. 準備工作,開水浴鍋,預熱試劑,超凈工作臺紫外照射 30min,找到對應細胞在液氮罐中的位置
2. 紫外照射后風機吹 10min 后,酒精擦拭臺面,放入試劑和離心管,取 15ml 離心管,加入 9ml 培養液
3. 在液氮罐中取出細胞,先擰松放液氮,再擰緊,將凍存管放入 PE 手套中,然后水浴融化后取出,1-2min
4. 將凍存管噴酒精后放入超凈臺內,擦干管壁,用 1ml 頭將細胞轉移到已加培養液的離心管中
5. 800-1000rpm 離心 5min,注意配平
6. 將離心好的細胞棄上清,加入 5ml *培養基重懸,用移液管吹打 8-10 次, 避免產生氣泡,將細胞懸液接種到 10cm 培養皿中,補加 5ml 培養液
7. 混勻,十字法或者 8 字法
8. 將混好的細胞放入培養箱中培養 復蘇操作要點:
1)將培養基在37℃水浴鍋預熱;準備一個15mL無菌的離心管,加入8mL預熱培養基。
2)將凍存細胞從液氮罐中取出,快速放入37℃水浴鍋中復溫(可準備一潔凈的燒杯,裝滿37℃的水,細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內,再逐步轉移到水浴鍋中)。輕輕晃動凍存管,使細胞能在1~2min內*解凍,使細胞能盡快通過zui易受損的溫度段(-5~0℃)。注意凍存管管口不能沒入水中,BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。
3)用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內,將管內細胞轉移至準備好的離心管內,輕輕吹打液體,使細胞均勻分散,降低DMSO濃度,吹打時避免產生氣泡。用新鮮培養基洗管壁2次,均轉移至離心管內。
4)800rpm離心5min,棄上清,加入新鮮的培養基,吹打制成細胞懸液。
5)將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內,補加適量的培養基,輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻,放入溫箱內培養。
6)第二天觀察細胞貼壁生長情況,換新鮮培養基以去除死細胞。繼續培養,待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經過2~3次傳代,細胞活力恢復后才能進行后續的實驗。

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