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試劑顯色時 A、B 液按順序加入且間隔不超過 10min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。顯色劑不宜過多，注意避光反應。顯色是最后一步溫育反應，酶將無色底物催化反應呈有色，反應的溫度和時間均為影響結果的重要因素，目前市場上大多數進口的 ELISA 檢測顯色溫度處于 18~30℃。一定時間內，陰性孔可保持無色，但陽性孔會隨時間的延長而顯色加強。研究表明，顯色溫度對實驗結果有明顯影響，顯色溫度不同，試劑最di檢測能力差距非常大，溫度低于 21℃時試劑盒對于質控物的檢出能力下降，溫度過低導致結合反應速率變慢，顯色不充分，造成低值陽性結果的漏檢，所以操作中應嚴格控制溫度。顯色時間不宜過短，因為一些低滴度可能不能及時出現反應，造成假陰性結果。結果判斷應按照說明書在規定時間內完成，研究報道終止反應后的時間對 OD 值結果有明顯影響，10~15min陽性結果 OD 值逐漸下降，陰性結果的 OD 值有所上升，所以必須嚴格按照操作說明進行，薛春楊等認為結果判斷需在加入終止液后 10min 內完成，避免出現孔內結晶影響酶標儀的測試，避免強光下進行。
在加液和混合過程中產生氣泡、微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規則的表面都可能引起吸光值的升高，易造成假陽性結果，若顯色但酶標儀讀值為陰性的灰色值樣區的樣本不管其是否來源于高危人群均需復檢并參考參比試劑。
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