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貨號	FS-X9662

培養操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養板（每孔一片）或培養皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經過計數的細胞懸浮液移入培養板中，使蓋玻片*浸在培養液中；

5．將培養板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養板底部2/3面積時，將培養板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

中文名稱：細胞凋亡檢測試劑盒IV(FITC+POD)

英文名稱：

產品規格：20T

貨號：FS-X9662

產品介紹:

保存條件：-20℃冰凍保存。

保存期：一年

工作原理：

在機體內部隨時都在發生著細胞的死亡。傳統上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質的濃縮及碎片的形成。但是這種現象出現的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質或DNA 被切割，出現單鏈或雙鏈缺口，并產生與 DNA 斷點數目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將標記的dUTP(DIG-dUTP)標記至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 結合在 DNA 斷點部位，可以通過生物標記的抗抗體(Anti-DIG-Biotin)反應后，再結合熒光素 FITC或者過氧化物酶 POD 標記的鏈酶親和素(SABC-FITC/SABC-POD)。FITC 在 490-495nm 激化，在 520-530nm 發射熒光，在熒光顯微鏡下呈明亮黃綠色。POD的在加入顯色底物 DAB 顯色后，凋亡的細胞核呈棕黃色。用戶根據實驗需要，在不同切片上用兩套不同顯示系統觀察。

試劑盒內容：

1．標記緩沖液(Labeling Buffer)1ml

2．末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT,×20)20μl

3．DIG-dUTP(×20)20μl

4．封閉液(Blocking Reagent)4ml

5．生物su化抗抗體(× 100)20μl

6．SABC-FITC(× 100)20μl

7．SABC-POD(× 100)20μl

8．Proteinase K(×200)50μl

9．抗體稀釋液 4ml

10．未染色陽性對照片 2 張。

實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；

5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

組蛋白脫乙酰基mei5(HDAC5)檢測試劑盒 forHistoneDeacetylase5(HDAC5)

內分泌腺來源血管內皮生長因子(EG-VEGF)檢測試劑盒 forEndocrineGlandDerivedVascularEndothelialGrowthFactor(EG-VEGF)

肌球蛋白重鏈7(MYH7)檢測試劑盒 forMyosinHeavyChain7,CardiacMuscle,Beta(MYH7)

脂su3(LPIN3)檢測試劑盒 forLipin3(LPIN3)

血管緊張su原(AGT)檢測試劑盒 forAngiotensinogen(AGT)

著絲粒蛋白I(CENPI)檢測試劑盒 forCentromereProteinI(CENPI)

多型性腺瘤基因樣蛋白1(PLAGL1)檢測試劑盒 forPleiomorphicAdenomaGeneLikeProtein1(PLAGL1)

骨成型蛋白4(BMP4)檢測試劑盒 forBoneMorphogeneticProtein4(BMP4)

乙chun脫氫mei6(ADH6)檢測試劑盒 forAlcoholDehydrogenase6(ADH6)

骨成型蛋白受體1A(BMPR1A)檢測試劑盒 forBoneMorphogeneticProteinReceptor1A(BMPR1A)

涎福林蛋白(SPN)檢測試劑盒 forSialophorin(SPN)

脂聯su受體1(ADIPOR1)檢測試劑盒 forAdiponectinReceptor1(ADIPOR1)

低氧誘導因子1α(HIF1α)檢測試劑盒 forHypoxiaInducibleFactor1Alpha(HIF1a)

中性粒細胞彈性蛋白mei(ELA2)檢測試劑盒 forElastase2,Neutrophil(ELA2)

腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒 forBrainDerivedNeurotrophicFactor(BDNF)

鈉/鉀離子轉運ATPmeiβ3肽(ATP1β3)檢測試劑盒 forATPase,Na+/K+TransportingBeta3Polypeptide(ATP1b3)

血管緊張suⅡ(ANGⅡ)檢測試劑盒 forAngiotensinII(AngII)
細胞凋亡檢測試劑盒IV(FITC+POD)醋suan胍那芐標準品規格:200mg 英文名稱：Guanabenz Acetate

鹽suan利托君標準品規格:200mg 英文名稱：Ritodrine Hydrochloride

哈拉標準品規格:200mg 英文名稱：Halazepam CIV (AS)

左美諾chun標準品規格:100mg 英文名稱：Levomenol

鹽suanjiaben噻嗪標準品規格:200mg 英文名稱：Xylazine Hydrochloride

葡庚糖suan紅霉su標準品規格:200mg 英文名稱：Erythromycin Gluceptate

咪康zuo標準品規格:200mg 英文名稱：Miconazole

水飛薊su標準品規格:50mg 英文名稱：Silybin

zuo來瞵suan相關物質A標準品規格:30mg 英文名稱：

碘昔蘭相關物質A標準品規格:100mg 英文名稱：Ioxilan Related Compound A
操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)