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PCR反應中的引物二聚體應對方法

時間:2024/5/27閱讀:572
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PCR(聚合酶鏈式反應)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點,是能將微量的DNA大幅增加。如果反應出現了引物二聚體,有許多方法可以減少或消除反應中的引物二聚體。

1、 首先是優化熱循環條件,這主要是提高退火溫度。大多數情況下,兩步循環 (由 95°C 變性步驟直接進入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強效擴增,因此引物設計時設定的成功退火溫度為 60°C。

2、可降低引物濃度,甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數情況下,每條引物的理想最終濃度為 200 nM,但如有需要,可將濃度降至 60 nM。

3、鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。

4、如果未對引物形成二聚體的傾向進行評估,則應補充評估并考慮重新設計 (如有需要)。通常情況下,最好使用熱啟動 DNA 聚合酶,并在冰上進行反應。

5、在理論上,針對同一靶點應同時檢測多個引物組。這實際上可以節省大量時間,因為如果這些引物中的一個能立即發揮作用,則可以減少花費在優化過。


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