細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些不同？
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些不同？
⒈DEAE-葡聚糖
這是早在1965年出現(xiàn)的轉(zhuǎn)染方法。帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體可以結(jié)合帶負(fù)電的DNA分子，使得DNA復(fù)合物結(jié)合在帶負(fù)電的細(xì)胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克，也可能是細(xì)胞內(nèi)吞作用使得DNA復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞。DEAE-葡聚糖于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，可重復(fù)性好，轉(zhuǎn)染時(shí)要除掉血清。
⒉磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染
早在1973年開始采用。氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞孵育時(shí)間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，重復(fù)性不佳。此法較易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，但轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞比較困難。
⒊電穿孔法
通過(guò)短暫的高電場(chǎng)電脈沖處理細(xì)胞，沿細(xì)胞膜的電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時(shí)穿孔。DNA被認(rèn)為是穿過(guò)孔擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。理論上說(shuō)電穿孔法可用于各種細(xì)胞，且不需要另外采購(gòu)特殊試劑，但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA，因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。
⒋脂質(zhì)體法
中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體則不同，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體法始于1987年，此法的出現(xiàn)使得轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性和可重復(fù)性大大提高。陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高，對(duì)不同的細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。
⒌病毒介導(dǎo)的感染
感染需要將目的基因克隆到特定的病毒體系中，經(jīng)過(guò)包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的病毒，再進(jìn)行感染。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率特別高，尤其是難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、活體細(xì)胞。缺點(diǎn)是構(gòu)建病毒周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，易出錯(cuò)，費(fèi)用也高。
⒍非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
好的納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster試劑，納米材料，細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高，漸漸成為各大實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)染試劑。
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