惡性轉化細胞的誘發和培養方法!
惡性轉化細胞的誘發和培養方法!
細胞培養已成為研究癌癥的發病機制和腫瘤細胞生物學特性的常用方法。細胞培養提供的模型系統中,實驗變量可被嚴格控制,較使用整體動物更省時、價廉且易于操作。在基礎研究領域取得的理論和技術進展的基礎上,細胞培養體外系統為腫瘤研究提供了新的方法和應用領域,體外研究結果也為進一步的體內研究提供可借鑒的資料。細胞培養技術的進一步發展,將為細胞惡變機制研究提供新的平臺,并將促進腫瘤的基礎研究與臨床防治研究。
本章主要介紹腫瘤學研究和臨床實踐中涉及細胞培養的一些成熟技術方法。關于腫瘤的生物治療技術,早在1985年美國國家癌癥中心已經將生物治療正式列入腫瘤*的第四大模式。生物治療從臨床上廣泛應用LAK,TIL細胞開始出現“火熱”,中間曾由于濫用現象而走入過一段低谷,發展到今天又迎來了一個應用CIK細胞的高潮。由于過繼*的優點決定了它在腫瘤生物治療中的地位,因為腫瘤特異性抗原的研究仍未取得實質性的突破,腫瘤疫苗和靶向治療制劑的使用仍難達到理論上的期望值,恐怕過繼*在今后一段時間里仍將是腫瘤生物治療中重要的手段。關于LAK, TIL與CIK細胞的制備與功能檢測等。
節惡性轉化細胞的誘發和培養
癌變,即細胞惡性轉化,是一個發生在體內的過程,在體外細胞培養條件下,也可以用人工方法誘發。人工誘發體外培養細胞的轉化,是研究癌變原理的重要方法,其優點是重復性好,可用于研究各種可致癌因素的作用,細胞發生轉化后,能夠進行直接觀察和做各種分析。人工誘發轉化產生的體外癌變模型,不僅在理論研究中有重要作用,亦可應用于檢測環境中的致癌物。
一、人工誘發細胞惡性轉化
在細胞培養條件下,用化學、物理和生物等各種致癌物可人為地誘發細胞發生惡性轉化。條件是要讓細胞直接受到致癌物的作用,從細胞接觸致癌物到發生惡性轉化一般需兩周到三個月的時間。
(一)細胞轉化基本過程
⒈誘發也稱啟動,是致癌物或誘變劑誘發DNA損傷的過程。誘發因素可分為物理因素,例如,射線;化學物質,即致癌化合物以及生物因素,例如某些病毒(EB病毒、人瘤病毒等)、等。應用射線時,可直接照射細胞,在用致癌化學物或病毒時,需把這些物質加到培養物中,使之與細胞直接接觸,但細胞受致癌物作用時間過長,或致癌物劑量過大,可導致細胞死亡。因此應用致癌物的劑量和作用時間要控制在能使細胞傷而不死,處于DNA合成階段的細胞易受到致癌物損傷,因此讓致癌物接觸細胞的時間不宜少于6小時,但也不得超過48小時。在實驗中常用的是致癌化學物,可分為直接致癌物與間接致癌物。直接致癌物如N-甲基-N’-硝基-N-亞( N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ; MNNG)能直接損傷DNA誘發癌變;間接致癌物又稱前致癌物,需經某些酶的活化,形成終末致癌物后,才能發生致癌的作用,終末致癌物具有強的親電子性質,易與細胞核中含電子多的DNA,RNA和蛋白質等相結合,從而導致DNA的損傷,發生轉化過程中的啟動作用。
⒉DNA的損傷與修復DNA損傷后可進行自我修復。修復是一復雜的過程,存在著不同修復機制和產生不同的結果。無誤性的修復可使損傷DNA復原,但錯誤性修復能引起DNA的結構發生改變。當DNA損傷后如發生了錯誤性修復,而這種變化被固定下來即能引起不可逆的改變,標志著DNA發生了突變。從啟動到損傷被固定下來,大約需24~48小時完成。
⒊發展和表現細胞DNA受損和被固定后,通過細胞的反復增殖,使細胞損傷進一步得到發展和表現。受到一定劑量致癌物處理的細胞群,并非所有細胞都一定受到損害。受到誘發并進入轉化發展階段的細胞僅是一小部分,這些細胞稱為癌前細胞(precancerouscell)。它們生長在那些未受損的正常細胞之中,這兩類細胞大約共同經過12~15個細胞周期的增殖以后,可能細胞已相互匯合融合成片。正常細胞不再分裂,但那些散在的前癌細胞卻隨著轉化而不斷發展,細胞匯合后不發生接觸抑制,仍繼續分裂增殖,并由于數量的增多而堆積起來,形成明顯可見的轉化灶。
(二)轉化實驗方法
【材料】
⒈實驗用細胞進行轉化實驗需選用合適的細胞,來源主要分以下兩類
⑴原代細胞:原代培養的二倍體細胞易于制備,細胞發生轉化后也容易識別,動物和人的原代培養細胞皆可應用。動物細胞以倉鼠胚胎成纖維細胞(embryonic fibroblast,EFs)較好,人原代細胞取自胚胎,小兒和成人真皮等。
⑵傳代細胞系:BALB/3T3,C3H10T1/2,BHK-21,NIH3T3,V79細胞株等均可。這些細胞的共同特點都已獲得了無限生長的能力,變成了傳代細胞系,也失去了二倍體核型,說明這些細胞都已發生了一定程度遺傳變化,但卻保持著正常細胞的接觸抑制特征,而且接種同源動物體內無致癌性。
⒉培養液與試劑
⑴*培養液:85%高糖DMEM;15% FBS;O.1mM NEAA;2Mm/L*。
⑵低血清培養液:95%高糖DMEM;5% FBS;O.1mM NEAA;2Mm/L*。
⑶消化液:0.25% Trypsin-0.02% EDTA.
⑷凍存液:90% FBS;10% DMSO。
⑸Hanks液。
⑹MNN溶液。
【方法】
用原代細胞進行轉化實驗。多選用倉鼠13天的胚胎EFs。
⒈取數個或所有同窩胚胎,去頭和內臟,在無菌條件下剪碎至米粒大小,再用消化液37℃消化30分鐘,吹打數次后過濾,1000r/min,離心5分鐘。去除上清消化液,加Hanks洗1次,沉淀細胞加入培養液,制備5x105/ml細胞懸液,接種入培養瓶中,37℃培養2~3天,能迅速長滿瓶。
⒉選生長狀態良好的細胞,液氮凍存備用(傳代過多不利于細胞轉化)。
⒊致癌物處理凍存細胞解凍后,接種于25 ml培養瓶中,每瓶含細胞(1~3)x105。待細胞生長進入指增*時,向培養瓶中加入致癌劑。致癌劑常用MNNG,劑量為1~3ug/ml營養液,在37℃孵箱中培養12~48小時。
⒋棄掉MNNG作用液,用溫PBS洗1~3次,加入培養液繼續置孵箱培養2~3周(如用人細胞需1~3個月),然后更換培養液,用含5%血清培養液培養。低血清培養液不利于正常細胞生長,但已轉化了的細胞仍可增殖,易形成轉化灶。
⒌轉化灶的形成和分離用致癌物處理過的細胞于10天后,如果轉化成功,在正常細胞之間可產生數量不等的轉化灶。轉化灶由密集的重疊細胞群組成;灶的大小不等,小者由幾十或幾百個細胞構成,大者肉眼可見。
⒍轉化現象出現后,為獲得純的轉化細胞群,應把轉化灶分離出來。轉化灶分離可用兩種方法:
⑴刮除法:先在有轉化灶處瓶壁上用蠟筆圈出記號,再用膠皮刮刮掉未轉化的正常細胞,向瓶內加入PBS沖洗掉刮除后,加0.25 % Trypsin少許置37℃孵箱中消化5~10分鐘,待細胞松散后,棄掉消化液,加入新鮮的含10%~20%小牛血清培養液,以終止殘余*消化作用,用吸管反復吹打轉化灶,使之脫離瓶壁成細胞懸液,再置37℃孵箱。
⑵消化法:先在瓶壁上用蠟筆圈出轉化灶,棄掉瓶內培養液,選生長良好的轉化灶,用不銹鋼小環或無毒硅橡膠圈沾少許無菌明膠(不用亦可)套在轉化灶上;向圈中滴0.25% Trypsin充分消化后,用彎頭吸管把*與細胞一同吸出接種入新培養瓶中,再補加營養液少許;置孵箱中繼續培養。數日后轉化細胞迅速增殖成新的細胞群。
【結果】
⒈高倍鏡下觀察,轉化細胞與正常細胞不同,如系成纖維細胞發生轉化后,胞體變大成類多角形,生長無方向性,失去接觸抑制,向三度空間伸延,細胞相互重疊。在轉化灶的邊緣轉化細胞與正常細胞界限分明,形態區別非常明顯。上皮細胞轉化后,形態上不如成纖維細胞差別大,需仔細辨認。
⒉無限細胞系用BALB/3T3或C3 H10T1/2細胞等,比原代細胞操作更簡單,而且成功率高。轉化程序與原代培養細胞相同。
【注意事項】
MNN溶液,有毒,用時注意防止污染環境;避光陰涼處保存,實驗用液現配現用。用MNNG處理細胞不宜超過48小時。
(三)轉化細胞的檢測
用誘變劑或致癌劑誘發細胞轉化,獲得轉化細胞群后,為確定轉化細胞的性狀,需進一步做一系列的實驗分析。
⒈細胞生物學一般性狀包括細胞形態、生長速度、倍增時間等。
⒉細胞遺傳學特征核型分析,染色體組型畸變和標志染色體的有無。
⒊惡性測試侵襲性試驗,軟瓊脂培養,異體動物接種,凝集試驗等。
以上測試中重要的為第3項,說明發生轉化的細胞是否為惡性轉化。
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