?在BEL-7404人肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除了常規(guī)的無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)條件控制外，還需特別注意以下幾點(diǎn)：

1. 細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)把控

該細(xì)胞系貼壁生長(zhǎng)時(shí)易形成重疊堆積，建議在融合度達(dá)80%-90%時(shí)立即傳代。過(guò)度生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間接觸抑制增強(qiáng)，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。傳代時(shí)建議采用0.25%-0.02%EDTA混合消化液，終止消化后需輕柔吹打以避免細(xì)胞團(tuán)塊形成。

2. 特殊培養(yǎng)基要求

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中需添加10%胎牛血清和1%雙抗，但需注意該細(xì)胞系對(duì)血清批次敏感性強(qiáng)。新批次血清使用前應(yīng)進(jìn)行72小時(shí)生長(zhǎng)曲線測(cè)試，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖速率下降超過(guò)15%，建議更換血清批次。有文獻(xiàn)報(bào)道添加2mM可顯著提升細(xì)胞活力。

3. 凍存復(fù)蘇關(guān)鍵點(diǎn)

凍存時(shí)建議采用程序降溫盒，以1℃/min的速率降至-80℃后再轉(zhuǎn)入液氮。復(fù)蘇后換液需保留50%原培養(yǎng)液以減輕滲透壓沖擊。典型復(fù)蘇后貼壁時(shí)間為4-6小時(shí)，若超過(guò)8小時(shí)仍未貼壁，提示細(xì)胞狀態(tài)異常。

4. 實(shí)驗(yàn)干擾因素控制

該細(xì)胞系對(duì)溫度波動(dòng)敏感，培養(yǎng)箱溫度波動(dòng)超過(guò)±0.5℃會(huì)導(dǎo)致HSP70表達(dá)量顯著升高。建議在藥物處理實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞置于穩(wěn)定環(huán)境中培養(yǎng)至少3個(gè)代次。進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，質(zhì)粒用量需比常規(guī)細(xì)胞系減少30%，因其對(duì)脂質(zhì)體毒性耐受性較低。

5. 形態(tài)學(xué)監(jiān)控要點(diǎn)

健康細(xì)胞應(yīng)呈現(xiàn)典型的上皮樣多邊形，若出現(xiàn)梭形化改變往往提示支原體污染或血清失效。建議每周用Hoechst33342染色檢測(cè)一次核異常，該細(xì)胞系自發(fā)突變率較普通肝癌細(xì)胞高約1.7倍。