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PCR引物設計關鍵的原則

來源:上海邦景實業有限公司   2025年07月21日 14:09  

PCR引物是進行聚合酶鏈式反應(PCR)的關鍵組成部分,負責與目標DNA序列特異性結合并引導DNA聚合酶開始復制過程。引物設計的質量直接影響PCR的特異性和效率。

以下是一些關鍵的PCR引物設計原則:

1. 引物長度:通常在15-30bp之間,常見的為18-27bp,不宜超過38bp,因為過長可能導致延伸溫度過高,影響Taq DNA聚合酶的活性。

2. GC含量:理想范圍是40%-60%,45-55%為佳,以確保引物與模板的穩定結合而不至于過強或過弱。

3. Tm值:引物與模板結合的Tm值應接近72℃,至少應在55-80℃之間,這有助于優化復性條件。Tm值可以通過多種方法計算,包括公式法或軟件中的鄰近法。

4. 3’端設計:避免在3’端使用A,因為A在錯誤引發位點的引發效率較高。同時,避免3’端出現3個以上的連續堿基(如GGG或CCC),以及可能形成的發夾結構和二聚體。

5. 模板序列的相似性:引物設計應確保與非特異擴增序列的同源性不超過70%,且無連續8個堿基的互補,以減少錯誤引發。

6. 引物自身和相互間的互補性:引物5’端可以修飾,但整個序列應避免連續4個堿基的互補,以防止發夾結構和引物二聚體的形成。

7. ΔG值:引物的自由能(ΔG)分布應呈正弦曲線,即3’端較低,而5’端和中間較高,且3’端的ΔG值絕對值不應超過9。<cite>2</cite>

8. 特異性:引物應設計在核酸保守區內,且與非特異擴增序列的同源性不高于70%或有連續8個互補堿基。


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