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Plant Physiol | DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合助力揭示黃瓜皮色調(diào)控新機(jī)制

來(lái)源:藍(lán)景科信河北生物科技有限公司   2025年06月23日 11:46  

研究背景

黃瓜不僅為全球廣泛種植的蔬菜之一,也是中國(guó)重要的蔬菜作物之一,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。果皮顏色是黃瓜品質(zhì)性狀的重要標(biāo)準(zhǔn),它能夠大大影響消費(fèi)者的選擇,具有重要的商品價(jià)值。果皮的顏色主要取決于色素的含量和形成,其中葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮化合物等的含量是影響果皮顏色的主要因素。目前雖已鑒定出多個(gè)調(diào)控果皮顏色的基因,但其參與顏色調(diào)控的分子機(jī)制尚不明確。

文獻(xiàn)解讀

20256月,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)任華中/劉興旺團(tuán)隊(duì)在Plant Physiology發(fā)表了題為“The transcription factor CsAPRR2 controls peel color by regulating the expression of SULFURTRANSFERASE14 in cucumber”的研究論文。本研究借助RNA-seq技術(shù)成功挖掘到控制黃瓜商品瓜皮色黃化的關(guān)鍵基因CsAPRR2,同時(shí)利用DAP-seq聯(lián)合RNA-seq分析解析了其在全基因組水平的DNA結(jié)合位點(diǎn),揭示其調(diào)控黃瓜皮色的分子機(jī)制,為深入理解植物果實(shí)皮色形成的分子基礎(chǔ)提供了新的視角,同時(shí)也為利用基因編輯技術(shù)調(diào)控黃瓜果實(shí)外觀品質(zhì)提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

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技術(shù)路線

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研究結(jié)果

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)多代自交培育出僅皮色不同的近等基因系6101-11(黃皮)和6101-12(綠皮)。表型分析顯示,兩者從開花當(dāng)天起葉綠素含量出現(xiàn)顯著差異;電鏡觀察表明,6101-11因葉綠體發(fā)育異常導(dǎo)致葉綠素合成減少而呈黃色。遺傳分析證實(shí)黃皮為單基因隱性性狀,通過(guò)BSA-seq分析,在3號(hào)染色體末端定位到2.73Mb區(qū)間,再經(jīng)Indel標(biāo)記篩選將目標(biāo)基因縮至198.7kb區(qū)域。結(jié)合RNA-seq分析,從3959個(gè)差異基因中篩選出5個(gè)候選基因,其中Csa3G904140CsAPRR2)因單堿基插入導(dǎo)致C端缺失101個(gè)氨基酸、丟失Golden2-Like結(jié)構(gòu)域,且與甜瓜皮色調(diào)控基因CmAPRR2親緣關(guān)系近,確定其為調(diào)控黃瓜皮色的候選基因。

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圖1. 黃皮突變體的表型特征。

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圖2. 基于圖譜克隆的CsAPRR2基因。

研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)在CsAPRR2第10、11外顯子設(shè)計(jì)靶點(diǎn),獲得三個(gè)純合突變株,其Golden2-Like結(jié)構(gòu)域缺失。突變體表現(xiàn)出果皮、莖稈和葉柄黃化,葉綠素含量降低,葉綠體體積縮小、膜結(jié)構(gòu)模糊、基粒異常且無(wú)淀粉顆粒等表型,雖然葉綠體數(shù)量不變,但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量下降,證實(shí)CsAPRR2是黃皮核心基因。亞細(xì)胞定位顯示,CsAPRR2定位于細(xì)胞核,突變后出現(xiàn)在細(xì)胞膜、細(xì)胞核和葉綠體。酵母實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶系統(tǒng)證實(shí)其具有轉(zhuǎn)錄激活活性,突變體活性減弱。

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圖3. CsAPRR2基因在黃瓜中的功能驗(yàn)證。

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圖4. CsAPRR2的亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄活性。

為深入解析CsAPRR2介導(dǎo)的果皮黃化分子機(jī)制,作者通過(guò)RNA-seq分析,篩選到5146個(gè)差異基因,GO富集分析顯示這些基因主要富集于葉綠體等組分及光合作用相關(guān)過(guò)程;WGCNA分析篩選出與皮色正相關(guān)的綠色模塊,并得到113個(gè)核心網(wǎng)絡(luò)基因。通過(guò)DAP-seq分析,發(fā)現(xiàn)其結(jié)合峰值主要富集于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上下游2kb區(qū)域,結(jié)合基序?yàn)?/span>ATCGTTTAGATTTGG。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù),篩選出103個(gè)共同基因作為直接靶基因,GO富集分析顯示這些基因顯著富集于葉綠體、類囊體等細(xì)胞組分。經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)csaprr2突變體中6個(gè)葉綠體相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào),其中Csa3G238120CsSTR14)因在突變體中表達(dá)差異顯著、參與硫代謝及鐵硫簇組裝,且存在于WGCNA綠色模塊,被確定為CsAPRR2的直接靶基因。進(jìn)一步通過(guò)酵母單雜交、雙熒光素酶報(bào)告基因、EMSA實(shí)驗(yàn)及表達(dá)模式與亞細(xì)胞定位分析,證實(shí)CsAPRR2能特異性結(jié)合CsSTR14啟動(dòng)子的E1元件并激活其表達(dá)。在突變植株中,csaprr2的轉(zhuǎn)錄激活能力降低,盡管結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有變化,但突變后的APRR2對(duì)CsSTR14啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合親和力顯著減弱,導(dǎo)致CsSTR14表達(dá)下調(diào),進(jìn)而影響了黃瓜果皮中硫的運(yùn)輸,最終影響葉綠體結(jié)構(gòu)的發(fā)育,造成果皮黃化。這一發(fā)現(xiàn)不僅為深入理解果皮顏色形成的分子機(jī)制提供了新的視角,同時(shí)為硫代謝調(diào)控葉綠體發(fā)育的研究拓展了新的方向。

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5. 黃瓜CsAPRR2結(jié)合基因的全基因組分析。

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6. CsAPRR2直接結(jié)合CsSTR14并激活其表達(dá)。

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7. CsAPRR2通過(guò)調(diào)控黃瓜中CsSTR14基因的表達(dá)來(lái)影響黃瓜果皮顏色。

 


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