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PCR反應污染詮釋

來源:上海撫生實業有限公司   2023年12月25日 14:05  

        PCR擴增產物污染,這是PCR反應中最主要最常見的污染問題,所以,擴增區的儀器什么如槍頭等要注意。還有一種容易忽視,最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應管,開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。
1. 標本處理區,包括擴增摸板的制備;
2. PCR擴增區,包括反應液的配制和PCR擴增;
3. 產物分析區,凝膠電泳分析,產物拍照及重組克隆的制備。
  各工作區要有一定的隔離,操作器材專用,要有一定的方向性。如:標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記:產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
  使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染;
  操作多份樣品時,制備反應混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應的精確度

反應液污染:
可采用下列方法之一處理:
1. DNase I法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室溫反應30 min后加熱滅活,然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列;
2.尿mi 啶糖苷酶(UNG)法:
由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好,而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右,因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。

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