1、 菌株

用GS115表達(dá)不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達(dá)。

2、溫度：
　在28度和室溫下誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)水平可能都不低。

3、pH

手冊(cè)上用6.0，pH提高到6.8，不表達(dá)的蛋白可能就表達(dá)出來(lái)。BMMY的pH7.0-7.5比較合適。國(guó)內(nèi)外做的的rHSA，zui適pH大概5-6左右。pH3的時(shí)候yeast和peptone好像會(huì)沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調(diào)，具體比例自己去試試。
 

4、偏愛(ài)密碼子

codon bias一般不是主要的問(wèn)題，你要表達(dá)的蛋白特性才是主要問(wèn)題，酵母對(duì)分子量大（30KD以上），結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如一些蛋白酶），二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達(dá)，尤其是分泌表達(dá)。密碼子改造對(duì)一些較小的而且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的蛋白表達(dá)量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用Pichia酵母表達(dá)一個(gè)單鏈抗體，29KD，含有2對(duì)二硫鍵，表達(dá)量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達(dá)量沒(méi)有什么提高。

5、表達(dá)時(shí)間與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照

誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)了以后，是會(huì)有很多蛋白分泌出來(lái)的，時(shí)間越長(zhǎng)雜蛋白就越多，且分子量都比較大。做一個(gè)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對(duì)照，這樣就會(huì)比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結(jié)果。

6、污染

每個(gè)樣品從G418板上挑10個(gè)左右單克隆于2ml BMGY搖菌（30ml玻璃管，比LB管大一點(diǎn)），紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml，余1ml換2ml BMMY誘導(dǎo)表達(dá)，3,4層紗布足夠了。

污染一般都是跟瓶口覆蓋有關(guān)的原因造成的，只蓋紗布肯定會(huì)污染。加蓋報(bào)紙后，就再?zèng)]遇到過(guò)污染。如果只用6層紗布，污染的可能當(dāng)然很大，100ml三角瓶，裝量10ml培養(yǎng)液，用橡筋把8層紗布和2層報(bào)紙拴緊封口，空氣浴搖床。

7、不表達(dá)

蛋白有沒(méi)有表達(dá)就要看你的運(yùn)氣了，一般重復(fù)2－3次實(shí)驗(yàn)都沒(méi)有表達(dá)菌株，這個(gè)蛋白就放棄表達(dá)了。

8、表達(dá)量

30KD,10mg/L表達(dá)量已經(jīng)很高，zui直接的方法是發(fā)酵，一般提高5－10倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團(tuán)的超表達(dá)蛋白。

9、糖基化

酵母分泌表達(dá)的N糖基化是可以預(yù)測(cè)的，有如下序列：N X S/T就是潛在的糖基化位點(diǎn)，X為任意氨基酸，1個(gè)糖基化位點(diǎn)會(huì)加上1－3KD左右的糖基。另外可能還有O糖基化話，但是無(wú)法預(yù)測(cè)其位點(diǎn)，不過(guò)很少聽(tīng)說(shuō)表達(dá)蛋白有O糖基化的。如果胞內(nèi)表達(dá)，不存在糖基化的問(wèn)題。

10、表型與表達(dá)

重組SalI和BglII酶切產(chǎn)生單交換和雙交換，結(jié)果就是產(chǎn)生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)生長(zhǎng)快，消耗的甲醇多，后者生長(zhǎng)慢，消耗的甲醇少，所以誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多，但是對(duì)某些蛋白Muts菌株可能表達(dá)的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達(dá)較好。

11、培養(yǎng)基

YPD：zui基本的培養(yǎng)用；BMGY：誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用；BMMY：誘導(dǎo)表達(dá)用；MD：電轉(zhuǎn)化后篩選his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因?yàn)橛衅咸烟牵@樣殘留的葡萄糖會(huì)影響下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。不過(guò)有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會(huì)抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、*。配制BMMY時(shí)也沒(méi)必要用5%過(guò)濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加甲醇至你要的濃度。

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