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細胞凋亡檢測形態學檢測方法及缺點

時間:2018/3/27閱讀:337
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細胞凋亡檢測的早期形態學改變是核染色質濃聚、固縮,聚集在核膜周邊,然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片,細胞膜將胞質和染色質斷片包裹,胞漿內形成多個膜結構尚完整的“小泡”及 “凋亡小體” (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。
       根據凋亡細胞固有的形態特征,至今為止,已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。
       一、光學顯微鏡觀察

       凋亡細胞的主要特征為核染色質致密深染,形成致密質塊,有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小,胞質致密、嗜酸性染色增強,并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在,凋亡細胞與周圍細胞分離,不引起炎癥反應。
本方法簡便易行,但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難,常缺乏較為特征的指標,具有較強的主觀性,重復性差。本方法可用于調亡現象的初步觀察,作為分析指標之一。
       檢測方法:細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色,在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態改變,結合顯微測量工具可作凋亡細胞計數。
       二、視頻時差顯微技術
       此方法用于細胞培養,通過相差顯微鏡可動態觀察細胞凋亡的變化過程,尤其是觀察細胞表和外形的變化。凋胞與基質分離,胞體變圓、收縮、出泡,有的細胞拉長,出現釘狀突起,特續數小時后細胞膜破裂,細胞溶解,通過連續觀察,本方法可養壑培養中的凋亡細胞,但不能用于病理組織。
       檢測方法:收集2×105細胞/ml培胞,置于多孔培養板,加入凋亡誘導劑,在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態改變,每隔分鐘30秒作序列攝影,連續24小時。如同進進行熒光染色,可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。
       三、電子顯微鏡觀察
雖然光學顯微鏡下可以看見胞膜起泡現象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態學變化大多發生在超微結構,因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結構在凋亡不同時期的變化。電鏡形態學觀察是迄今為止判斷凋亡經典、可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。
缺點:
       (1)只能定性,不能定量;
       (2)標本處理過程復雜,設備相對昂貴,對檢查者的技術水平要求較高,不適于大批標本檢測;
       (3)在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現染色質濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。
       細胞凋亡檢測檢測方法:透射電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定,丙酮脫水,環氧樹脂包埋,超薄切片,醋酸枸椽酸電子又重染色,透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定,乙醇逐級脫水,CO2臨界點干燥,真空噴金,掃描電鏡觀察。
Benzaldehyde (List Chemical)    苯甲醛標準品    100-52-7    1ml
Poloxamer Liquid    泊洛沙姆液標準品    9003/11/6    1ml
Phenylethyl Alcohol     苯乙醇標準品    1960/12/8    1ml
    間甲酚        1ml
Lutein     葉黃素標準品        1ml
    蒼白松果菊標準品    97281-15-7    1g
Powdered Ashwagandha Extract    醉茄粉末提取物標準品    90147-43-6    1g
Polyoxyl 20 Stearyl Ether (AS)    聚氧乙烯硬脂酸酯20標準品    9005-00-9     1g
Polyoxyl 2 Stearyl Ether (AS)    聚氧乙烯硬脂酸酯2標準品    9005-00-9     1g
Polyoxyl 10 Stearyl Ether    聚氧乙烯硬脂酸酯標準品    9005-00-9     1g
細胞凋亡檢測

 

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