在大elisa免疫檢測試劑盒中通常有3次加樣步聚，即加標本，加酶物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行濺起，不行產生氣泡。
加標本通常用微量加樣器，按規則的量參加板孔中。每次加標本應更換吸嘴，避免發作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。
有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，再在其間參加血清標本，然后在微型震動器上震動1分鐘以確保混和。加酶物使用液和底物使用液時可用定量多道加液器，使加液進程敏捷完結。在ELISA試劑盒中通常有兩次抗原抗體反響，即加標本和加酶物后。抗原抗體反響的完結需要有必定的溫度和時刻，這一保溫進程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA檢查試劑盒中似不恰當。
大elisa免疫檢測試劑盒屬固相免疫測定，抗原、抗體的只在固相表面上發作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標本，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗的機會，只要Z靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸。這是一個逐，因此需經分散
才干到達反響的結尾。在其后參加的酶符號抗體與固相抗原的也相同如此。這即是為什么ELISA檢查試劑盒反響老是需要必定時刻的溫育。
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體的適宜溫度。在樹立ELISA方法作反響動力學研討時，實驗標明，兩次抗原抗體反響通常在37℃經1-2小時，產品的生成可達高峰。為加快反響，可提高反響的溫度，有些實驗在43℃進行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中，以構成Z多的沉積。但因所需時刻太長，在大elisa免疫檢測試劑盒中通常不予選用。