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酶標(biāo)記抗體(結(jié)合物)的制備方法

時間:2024/12/9閱讀:423
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     結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體(或抗原),是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是 既保有酶的催化活性,也保持了抗體(或抗原)的免疫活性。酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種,即戊2醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。
1、戊2醛交聯(lián)法:戊2醛是一種雙功能團(tuán)試劑,它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊2醛直接加入酶與抗體的混合物中,反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效(結(jié)合率達(dá)60%-70%)和重復(fù)性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應(yīng)是隨機的,酶與抗體交聯(lián)時分 子間的比例不嚴(yán)格,結(jié)合物的大小也不均一,酶與酶,抗體與抗體之間也有可能交聯(lián),影響效果。諏講椒ㄖ校?br> 先將酶與戊2醛作用,透析除去多余 的戊2醛后,再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊2醛作用,再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的,較一步法 的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。
2、過dian酸鹽氧化法:本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物 酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時,過dian酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑,可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián) 結(jié),其最佳比例為:酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效,一般認(rèn)為是HRP最可取的標(biāo)記方法,但也有人認(rèn)為所有試劑較為強烈,各批實驗結(jié)果不易重演。 
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上,結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定,因經(jīng)過底洗滌,游離 酶可被除去,并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同,它會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原,從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng) 予純化,去除游離的酶和抗體后用于檢測,效果更好。純化的方法很多,分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法最為簡便,但效果并不理想,因為此法只 能去除留在上清中的游離酶,但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取,高效液相層析法可將制備的結(jié)合物 清晰地分成三個部分:游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得最佳的分離效果,但費用較貴。
結(jié)合物制得后,在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)?工作濃度。使用過濃的結(jié)合物,既不經(jīng)濟(jì),又可使本底增高;結(jié)合物的濃度過低,則又影響檢測的敏感性。所以必須對結(jié)合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是 指結(jié)合物稀釋至這一濃度時,能維護(hù)一個低的本底,并獲得測定的最佳靈敏度,達(dá)到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言,它的有效工作濃度 是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗時,能得到陽性反應(yīng)的最高稀釋度。例如某一HRP:抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000,表示該制劑經(jīng) 1:5000稀釋后,在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時,將發(fā)生陽性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測中,酶標(biāo)抗體的最適工作濃度受到固相載體 的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時間等的影響,因此必須在實際測定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的最大稀釋度作 為試劑盒中的工作濃度。

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