高效液相色譜法檢測飼料中孔雀石綠的方法
孔雀石綠（malachitegreen）又稱為苯胺綠、維多利亞綠或中國(China)綠，是一種具有金屬光澤的綠色晶體。孔雀石綠的化學官能團三苯沼氣(CH4)是一種致癌物資，且其易在魚體內和情況中殘留，存在致突變、致畸和致癌的危險，故我國、美國(United States)、加拿大(Canada)以及歐盟等很多國度均制止其在經濟魚類（觀賞魚除外）和人類食用魚中應用。魚粉是飼猜中動物卵白的重要起源，含有孔雀石綠及其代謝物的魚粉添加到飼猜中可經由進程食品鏈要挾到人類健康。
我所現采用NY/T 1756-2009標準，應用深圳普分科技有限公司高效液相色譜法（HPLC）對飼料中孔雀石綠進行測定，本標準適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預混合飼料、魚粉中孔雀石綠和無色孔雀石綠含量的測定。液相色譜法孔雀石綠和無色孔雀石綠的定量限均為 10μg/kg；液相色譜-串聯質譜法的定量限均為 1.0 μg/kg。現將該方法簡要介紹如下：
1.原理 以乙腈-乙酸鈉緩沖溶液提取樣品中的孔雀石綠和無色孔雀石綠，提取液經過二氯甲烷液液萃取，再經固相萃取柱凈化，用接有二氧化鉛柱的氰基柱進行高效液相色譜分離，紫外可見光檢測器檢測，外標法定量。
2. 分析步驟
2.1 提取 稱取飼料樣品約 5g (**到 0.001g) ，置于100ml離心管中，依次加入1.5ml鹽酸羥胺溶液、2ml對甲苯磺酸溶液、5ml乙酸鈉緩沖溶液和 20 ml乙腈，加入約2g 酸性氧化鋁，振蕩2min，超聲30 min，4 000 r/min 離心5 min。將上清液轉移至250 ml分液漏斗中，向離心管中再次加入20 ml乙腈，振搖2 min，4000 r/min 離心5 min，合并上清液至分液漏斗中。
2.2 液液萃取 加入50ml氯化鈉溶液、50ml二氯甲烷，旋搖，靜置分層。用蒸發瓶收集下層液體后，在分液漏斗再次加入 20ml二氯甲烷，旋搖，靜置分層，收集下層液體于同一蒸發瓶。將收集液35℃下減壓旋轉蒸發(注意：開始時溫度不要直接升35℃，以免爆沸)至近干，加入5 ml，乙腈溶解殘渣，備用。
2.3 凈化
2.3.1 固相萃取柱的活化 按中性氧化鋁柱在上、PRS 柱在下的順序將兩柱串聯，使用前用 5ml乙腈預洗兩柱。
2.3.2上樣 將2.3.1的樣液緩慢轉移到中性氧化鋁柱內,在抽真空情況下過柱(保持流速 1 ml／min) 。再用5ml乙腈洗滌蒸發瓶2次，洗滌液均轉移至柱內，*后用 5 ml乙腈洗滌小柱。
2.3.3洗脫收集 棄去中性氧化鋁柱，用乙腈-乙酸鈉緩沖溶液2ml、鹽酸羥胺甲醇溶液lml洗脫，收集洗脫液，過膜(孔徑0.45μm)，上機測定。
2.4樣品測定
2.4.1色譜條件
色譜柱：氰基柱，250 mm ×4.6 mm，柱后氧化鉛柱：35 mm×4.6 mm。 流動相：乙腈＋乙酸鈉緩沖溶液＝60＋40 (v＋v) ；
流速：1.0 ml/min 。
柱溫：室溫。
進樣量：50 μl。
檢測波長：600 nm。
2.4.2定量測定 按高效液相色譜儀說明書調整儀器操作參數。向液相色譜儀中注入孔雀石綠和無色孔雀石綠標準工作液及試樣溶液，得到色譜峰面積響應值，用外標法定量。
