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免疫熒光技術之染色方法

時間:2015/7/20閱讀:428
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一、制片

    選無自發性熒光的石英玻片或普通玻片,洗凈后浸泡于無水乙醇等量混合液中。用時取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。
二、固定

    除研究細胞表面抗原或不穩定抗原可不固定外,一般均應固定。
    固定的作用有三:
    1.  防止標本從玻片上脫落。
    2.  除去防礙抗原-抗體結合的類脂,使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果。
    3.  固定的標本易于保存,如組織切片固定后在-20℃下可保存一年而不改變其染色特性。

    標本的固定原則是:
    1.  不能損傷細胞內的抗原。
    2.  不能凝集蛋白質
    3.  不能損傷細胞形態。
    4.  固定后應保持細胞膜的通透性,以允許抗體進入與抗原結合。
三、水洗

    固定后以冷的0.01 Mol/L pH7.4PBS液浸泡沖洗,zui后以蒸餾水沖洗,防止自發性熒光。
四、染色

    染色分直接染色法與間接染色法。

    1.  材料與試劑

    (1)熒光抗體,稀釋至應用濃度。

    (20.01 Mol/L pH7.4PBS

    (39份甘油加1pH7.4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。

    (4)帶蓋方盤

    2.  直接染色法

    (1)將固定好的玻片置于濕盤中,滴加熒光抗體染色液,以覆蓋為度,加蓋,37℃感做30 min~45min

    (2PBS沖洗3次,每次沖洗3 min,即3×3沖洗。

    (3)蒸餾水沖洗。

    (4)滴甘油緩沖液一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。

    3.  間接染色法

    (1 檢查抗原:
    ①取固定標本,加已知的免疫血清37℃孵育30 min
    ②以PBS3×3沖洗。
    ③再加熒光標記的抗抗體,37℃孵育30 min
    ④PBS 3×3沖洗。
    ⑤H2O沖洗,涼干。
    ⑥加甘油緩沖液,封片、鏡檢。

    (2)檢查抗體:
    ①免疫后動物的淋巴組織涂片,自然干燥,甲醇固定。
    ②滴加相應抗原液(按1100~1500稀釋),37℃孵育30 min
    ③PBS3×3沖洗。
    ④加熒光抗體,37℃孵育30 min
    ⑤PBS3×3沖洗。
    ⑥水洗,涼干。
    ⑦加甘油緩沖液,封片、鏡檢。

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