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ELISA的基本原理、應用及方法和類型

時間:2015/6/18閱讀:1368
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 ELISA的基本原理有三條: 
    1)抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學活性;
    2)抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物,而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性; 
    3)酶結合物與相應抗原或抗體結合后,可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在,而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。

    ELISA法是免疫診斷中的一項新技術,現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定,根據已經使用的結果,認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查,而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此,也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體,而且也可用于測定體液中的循環抗原,所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用范圍日益擴大,可概括四個方面: 1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現微量的免疫沉淀反應。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

    方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法
  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為110μgml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml4℃隔夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。 
  2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。 
  3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml37℃孵育0.51小時,洗滌。 
  4. 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml371030分鐘。 
  5. 終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml 
  6. 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零后測各孔O·D值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

    方法二 用于檢測未知抗體的間接法: 
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110μgml 每孔加0.1ml4℃隔夜。次日洗滌3次。 
 
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照) 
 
于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml37℃孵育30-60分鐘,洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。 
 
其余步驟同“雙抗體夾心法"的456


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