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內切酶的特性、酶解與瓊脂糖凝膠電泳

時間:2015/6/4閱讀:297
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     限制性核酸內切酶:是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具,所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾等一起稱為工具酶。

     瓊脂糖凝膠電泳:是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質的特性,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負電的核酸分子就可以向陽極遷移。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率,因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的DNA*段。

     EB:即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽,(Ethidium Bromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結合。由于EB分子的插入,在紫外光的照射下,凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光,易于檢測??梢詸z測10ng DNA。

     質粒pCMV-Myc-T10 NEB 標準分子量片段(1kb DNA Ladder)EcoR1 Xho1 核酸內切酶(TakaraEcoR 1Xho 1酶解緩沖液(10×H buffer)瓊脂糖TBETAE緩沖液(10×)溴化乙啶染色液(10mg/ml)上樣液(6×)0.25% 溴酚蘭,40%(W/V)蔗糖水溶液或30%的甘油。電泳儀,電泳槽,紫外透射儀,凝膠成像儀,一次性塑料手套等.

     瓊脂糖凝膠的制備:稱取0.8g瓊脂糖,置于三角瓶中,加入100ml TBETAE工作液,瓶口倒扣一個小燒杯等,將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。

     膠板的制備:取有機玻璃內槽,洗凈、晾干;取紙膠條(寬約1cm),將有機玻璃內槽置于一水平位置模具上,放好梳子。將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液,小心地倒在有機玻璃內槽上,控制灌膠速度和量,使膠液緩慢地展開,直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右,待凝固*后,輕輕拔出梳子,在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻璃內槽放在含有0.5-1×TAETris-乙酸)或TBETris-硼酸)工作液的電泳槽中使用。

     加樣:用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內。每加完一個樣品,換一個加樣頭。加樣時應防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部,本實驗樣品孔容量約1520μl。1 kb DNA ladder(共10條帶): 在*個上樣孔或zui后一個上樣孔內加入6μl 1 kb DNA ladder50ng/μl )。

     電泳(帶上手套操作):

     1.加完樣后的凝膠板即可通電進行電泳; 

     2.建議在80100V的電壓下電泳;

     3.當溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1cm處停止電泳;

     4.將凝膠放入溴化乙啶(EB〕工作液(0.5μg/ml左右)中染色約20min。

     為了獲得電泳分離DNA*段的zui大分辨率,電場強度不應高于5V/cm(兩電極間的距離)。電泳溫度視需要而定,對大分子的分離,以低溫較好,也可在室溫下進行。在瓊脂糖凝膠濃度低于0.5%時,由于膠太稀,在4℃進行電泳以增加凝膠硬度。

     觀察與拍照:在紫外燈(310nm波長)下觀察染色后的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。紫外光激發(fā)30s左右,肉眼可觀察到清晰的條帶。在紫外燈下觀察時,應戴上防護眼鏡或有機玻璃防護面罩,避免眼睛遭受強紫外光損傷。拍照電泳圖譜時,可采用快速凝膠成象系統(tǒng)。

     對于未進行切的質粒來說,常會出現(xiàn)兩條電泳帶,一條是(松弛)螺旋狀質粒DNA帶,另一條是超螺旋狀質粒DNA的帶,以超螺旋狀質粒DNA居多,移動速度也zui快。有時還會出現(xiàn)三條帶,其中一條是因為有一些質粒DNA在提取過程中遭到損傷而線性化,其移動速度介于螺旋狀和超螺旋狀質粒DNA之間,所以該條電泳帶也位于上述兩種帶之間。如果提取的質粒很好時,這條帶會很弱,有時看不到。

     本實驗所用質粒pCMV-Myc-T10EcoR1單酶切后應為5.7kb;用EcoR1Xho1雙酶切后應產生兩條DNA*段,一條是3.8kb,另一條是1.9kb



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