【預期用途】

僅供科研使用，本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中高密度脂蛋白(HDL)含量。

【檢測原理】

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠高密度脂蛋白(HDL)水平。用純化的小鼠高密度脂蛋白(HDL)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入高密度脂蛋白(HDL)，再與HRP標記的高密度脂蛋白(HDL)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的高密度脂蛋白(HDL)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中小鼠高密度脂蛋白(HDL)濃度。

1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

120μmol/L 5號標準品 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

60μmol/L 4號標準品 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

30μmol/L 3號標準品 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

15μmol/L 2號標準品 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

7.5μmol/L 1號標準品 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

8.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

注意：

1.試劑準備：試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用。準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2.加樣：實驗操作中請使用一次性的滅菌吸頭，避免污染。加樣時注意不要有氣泡產(chǎn)生，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。與反應試劑加入一樣，加樣過程中第一個孔與最后一個孔加樣時間間隔盡量小（一般控制在10 分鐘以內(nèi)），如果太大，將會導致不同的“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。為了測值的準確性，推薦設置復孔進行實驗。

3.溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4.洗滌：濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。充分洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應孔內(nèi)殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應孔中吸水，同時要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數(shù)。如果使用自動洗板機，請在熟練使用后再用于正式實驗過程中。

5.反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化，如觀察到顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

6.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

【結(jié)果計算】

  以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。