流動(dòng)相： a、溶劑必須是HPLC級(jí)的，試劑則盡可能使用高純度的； b、不與固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，粘度小，且對(duì)樣品有適宜的溶解度，要求 k 在1～10范圍內(nèi)（可用范圍）或2～5（*范圍），k 值太小，不利于分離；k 值太大，可能使樣品在流動(dòng)相中沉淀； c 、 流動(dòng)相使用之前必須過濾和脫氣； d、確保溶劑間是相互混溶的； e、流動(dòng)相必須與檢測(cè)器相匹配，如用紫外檢測(cè)器時(shí)，不能選用截止波長(zhǎng)大于檢測(cè)波長(zhǎng)的溶劑。 痕量的雜質(zhì)會(huì)極大地降低色譜柱的性能，當(dāng)需要更換流動(dòng)相時(shí)，確保溶劑（緩沖液）之間是相互混溶的。若使用的溶劑與色譜柱中的溶劑不能混溶，則需使用過渡溶劑，否則會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生*性的傷害。鹽或緩沖液從流動(dòng)相中析出也會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生*性的傷害。每次進(jìn)樣前應(yīng)該檢查樣品在流動(dòng)相中的溶解性，如果可能盡量使用流動(dòng)相溶解樣品。 ②、固定相： a、流動(dòng)相的pH值應(yīng)保持在2.0－8.0之間（除非有特殊說明）； b、如果有必要可使用預(yù)飽和柱和保護(hù)柱； c、使用氨基柱時(shí)，流動(dòng)相和樣品中盡量避免含醛類和酮類物質(zhì)。 當(dāng)前的反相色譜柱填料可分為以下三種： ⒈硅膠柱：柱效高，機(jī)械強(qiáng)度大，但對(duì)pH敏感，低pH值（<2.0）會(huì)使鍵合相水解（除去鍵合的功能集團(tuán)）；高pH值（>8.0），硅膠溶解。如果流動(dòng)相的pH值接近2.0或8.0，需要使用預(yù)飽和柱。 ⒉有機(jī)聚合物填料：在寬pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，殘留硅羥基效應(yīng)較小；但其柱效低，機(jī)械強(qiáng)度不高，在不同的溶劑中可能縮水或溶脹。在應(yīng)用過程中，壓力不能超過其zui大能承受的限制，且流動(dòng)相中有機(jī)溶劑如甲醇、異丙醇、乙醇的含量不能超過10％。 ⒊有機(jī)－無機(jī)雜化粒填料：新開發(fā)的一種新型填料，由兩種高純的單體（有機(jī)聚合物和無機(jī)硅烷）合成的高純度填料，此類填料將硅膠填料和有機(jī)聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)有機(jī)地結(jié)合起來，柱效高、機(jī)械強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好、pH范圍寬，特別是表面和顆粒內(nèi)部的硅羥基大部分被有效的屏蔽，使其對(duì)堿性物質(zhì)的保留性能非常好。 ③、背壓（backpressure）和流速： a、保持背壓低于3500psi（245bar）； b、避免任何突然的壓力變化； c、如果背壓高（>3500psi），可反沖色譜柱，但流速應(yīng)為正常流速的1/5-1/2； d、如果檢測(cè)池需要除氣，可以使用背壓調(diào)控器（backpressure regulator）。 為zui大限度的延長(zhǎng)色譜柱的壽命，可根據(jù)色譜柱的填料的粒徑、色譜柱的內(nèi)徑對(duì)流速進(jìn)行調(diào)整，使得背壓<3500psi。如果背壓不超過界限，色譜柱的流速可任意設(shè)定