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上海金穗生物科技有限公司
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與噬菌體展示的多肽反應(yīng)的血清抗體的親和純化

時(shí)間:2013-3-18閱讀:314
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[器材和試劑]
● 直徑為60mm的聚苯乙烯培養(yǎng)皿(Falcon 1007)
● 包被緩沖液
● 單克隆抗體(mAb)57D1。該抗體能識(shí)別M13噬菌體次要衣殼蛋白(pⅢ)N末端。它是用M13噬菌體顆粒免疫大鼠而獲得的。來自含57D1雜交瘤細(xì)胞的上清用50%(NH4)2SO4沉淀,然后在PBS中溶解并透析,后抗體在蛋白G—Sepharose上免疫純化。
● PBST
● 封閉液
● PEG—純化的噬菌體
● 細(xì)菌提取物
● PEG—純化的nRl噬菌體
● *—HCl/BSA(100mmol/L*, 用HCl調(diào)至pH 2.7, 10ug/ml BSA)
● 2mol/L Tris—HCl,pH 9.4(新鮮溶液)

[方法]
1.將4m1包被緩沖液稀釋的PEG純化噬菌體(約1×1011TU/ml)等量分加在聚苯乙烯培養(yǎng)皿中。4℃在搖床上搖動(dòng)過夜。
2.棄去上清并在室溫下用PBST充分沖洗。
3.加6ml封閉液并在37℃搖床上搖動(dòng)孵育1小時(shí)。
4.在總體積為4ml的封閉液中,將40ul血清與100/xl細(xì)菌提取物和4×1012pfu經(jīng)PEG純化的nRl載體噬菌體混合,并在室溫下孵育60分鐘。
5.棄去封閉液。用PBST快速洗滌。將預(yù)孵育的混合物加到平板上。4℃在搖床上搖動(dòng)過夜孵育。
6.棄去溶液并在室溫下用PBST充分洗板。
7.除去洗滌緩沖液。加4ml*—HCl/BSA洗脫。室溫下?lián)u床孵育10分鐘。在含有-100ul 2mol/LTris—HCl pH 9.4的聚丙烯管內(nèi)進(jìn)行中和。
8.采用ELISA模式,用純化抗體來檢測噬菌體—多肽或抗原。

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