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上海金穗生物科技有限公司
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蛋白質純化親和層析法

時間:2013-1-16閱讀:243
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藥品試劑:
金屬螯合親和層析膠體 (Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210) 1 mL
◆ 在洋菜膠粒上接有nitrilotriacetic acid (NTA) 官能基,可以螯合鎳離子;使用前先以鎳離子飽和的。
Buffer B-300/0 (50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl)
◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol。
Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole
Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

方法步驟:
1) 親和層析膠體1 mL 已經裝填在管柱內,成為一淡藍色膠柱。請把管柱架直在鐵架上,去除下方的填塞物,用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口,準備注入樣本。
2) 除去膠面上方的緩沖液,并取出樣本 (IEX) 使其回到室溫,慢慢用滴管加到親和膠體上,小心勿弄亂膠體表面;讓樣本沒入膠體中,同時收集流出液每管2.5 mL。
3) 待樣本全部進入膠體后,關閉出口,再慢慢加入buffer B-300/20,打開出口收集流出液;buffer B-300/20 共流洗30 mL。
4) 接著以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上,收集各分劃。
5) 所有分劃均定量蛋白質并測定酶活性,收集酶活性高的數個分劃,共得 _______ mL (AF),保留100 μL 以供分析。

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