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使用*抗原來(lái)選擇gⅥ-CDNA噬菌體文庫(kù)

時(shí)間:2013-1-4閱讀:469
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[方法]
1.在2m1的PBS2M緩沖液中打散2mg*磁珠(200ul)并在室溫下旋轉(zhuǎn)機(jī)中孵育l小時(shí),再用PBST沖洗磁珠3次。
2.將2.5×1012TU的cDNA噬菌體文庫(kù)(大概要準(zhǔn)備250ml噬菌體文庫(kù))和用250ul PBS4M打散后的1mg磁珠混合,然后在室溫旋轉(zhuǎn)機(jī)中孵育l小時(shí),這一步要盡可能多地除去與*結(jié)合的噬菌體顆粒。
3.用收集器收集磁珠,將上清液轉(zhuǎn)移到新的微離心管中,加*誘餌(后濃度為250mmol/L)并在4℃旋轉(zhuǎn)機(jī)中孵育3小時(shí)。
4.加1mg磁珠(*步準(zhǔn)備好的)到噬菌體+誘餌混合物中并在4℃旋轉(zhuǎn)機(jī)中孵育30分鐘。
5.用收集器收集磁珠,用PBST沖洗磁珠10次,根據(jù)收集器將微離心機(jī)設(shè)置為瞬時(shí)離心以維持磁珠在微離心管的底部。
6.(a)在0.5ml的PBS和50mmol/L的DTT溶液中打散磁珠以便抽提噬菌體顆粒,在室溫下孵育10分鐘,然后用收集器收集磁珠并將上清液轉(zhuǎn)移到一新的微離心管中,在冰浴中保存溶液。(b)另一方面,在400ul 0.1mol/L*—HCl,pH 2.2溶液中打散磁珠,再在室溫下孵育10分鐘,然后用收集器收集磁珠并將上清液轉(zhuǎn)移到一新的微離心管中,加100ul 1mol/LTris—HClpH 8.0的溶液來(lái)中和該溶液,后在冰浴中保存溶液。7.將一半抽提出來(lái)的噬菌體(250ul)加10ml平板*0F細(xì)胞中⑧,在37℃孵育30分鐘。
8.取一等份感受態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞(100ul),連續(xù)稀釋然后將它們涂抹在LBAT平板上,37℃過(guò)夜孵育后計(jì)克隆數(shù)。
9.在20℃,2500g旋轉(zhuǎn)剩余的感受態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞10分鐘,除去上清液,然后在LBAT溶液中打散細(xì)胞顆粒,每一平方平板涂抹1m1細(xì)胞懸浮液,在37℃過(guò)夜孵育平板。
10.獲得并儲(chǔ)存選擇出的克隆,如果還需做進(jìn)一步的選擇,可以在裝有1 OD600細(xì)胞(8×108個(gè)細(xì)胞)的100m1搖瓶中接種20ml LBAT,并對(duì)噬菌體顆粒進(jìn)行獲取和純化處理。

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