一旦果蠅類標本被固定及透化處理后，便可加入抗體。如同其他免疫組化技術，可直接使用標記一抗，或者通過標記的二級試劑（能與一抗特異性結合）進行檢測。一般而言，直接標記一抗產生的信號更為清晰，背景較低。但其主要不足之處是如檢測多種抗原，就需分別制備和純化相應的多種標記一抗。因此，除了特殊情況以外，一般推薦使用間接法，該法所需的二級檢測試劑可以購自經銷商。
在大多數情況下推薦用酶標試劑，因其敏感度較高，使用普通的光學顯微鏡就可以觀察結果，如前所述。本節主要介紹熒光染料標記試劑的使用。如需要高分辨率或同時定位兩種抗原時推薦使用此法。熒光染料標記的檢測需要熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。
在抗原制備過程中研究者常采用幾種方法固定果蠅類標本，這就使得抗原經受的處理更為強烈，通常會遇到較高背景的問題。在果蠅類標本的免疫組化染色中，為消除較高背景可將樣本與正常羊血清預先孵育。大部分標記二抗試劑是羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白抗體。因而，選用非免疫羊的天然抗體來封閉非特異交互反應性位點，從而降低背景。此外，通過降低抗體濃度并孵育過夜亦可降低背景。
1．對照
特異性染色反應需要與對照進行比較。為了準確評價染色模式，應對來自同一種屬的兩種抗體進行比較。對于多克隆抗體來說，的對照是從用于制備特異性抗體的同一動物免疫前采集的血清，但已可以使用來自同種動物的非免疫血清。對于單克隆抗體來說，對照應該是與特異性抗體的來源相同；例如，雜交瘤細胞培養上清對比上清，小鼠腹水對比腹水，純化抗體對比純化抗體。對照抗體應該與特異性抗體的類和亞類相同。來自親代骨髓瘤的細胞培養上清不宜作為對照，因其中不含抗體。適宜的對照雜交瘤細胞株可從美國ATCC或歐洲動物細胞培養保藏中心獲得。此外，對二級試劑亦應進行檢測。
2．準備工作
進行抗體結合和檢測重要的準備工作是進行一抗和二抗的滴度測定。雖然在下述方法中建議抗體的加入初始量，但在免疫染色中應調整一抗、二抗的用量，以便達到足以引起強大有效信號的低濃度，以免發生非特異性染色。對每一種抗體（存在于蛋白緩沖液中，如1％IgG／PBS）做一系列稀釋并觀察其對靶細胞的染色效應。1／3稀釋（1份抗體中加入2份緩沖液）將接近其半對數值，并對所加入量進行合適的快速測定。對于*抗體的每一個滴度測定應進行重復實驗。而二抗一旦確定其稀釋度，就可以作為該批抗體的標準用量。如有可能，應該對攜帶所研究抗原基因缺失的果蠅類標本同時進行染色。這將為特異性抗體提供一個*的遺傳對照。
3．所需溶液與試劑
*抗體溶液；第二抗體（多數來自商品試劑）；PBS；含1％正常羊IgG的PBS。
4．特殊設備
熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。
