一、 產(chǎn)品基本介紹
1.1物理結(jié)構(gòu)
USphereTM bubble contrast agent 系臨床前超聲成像造影劑（僅供科研用途），經(jīng)靜脈注射后，可增強(qiáng)血液中的超聲信號(hào)，達(dá)到增強(qiáng)心血管疾病診斷或腫瘤檢測(cè)等目的。本超聲造影劑以八氟丙烷（Octafluoropropane， Perflutren，C3F8）氣體為核心氣體，外部以磷脂質(zhì)（Phospholipids）材料作為殼層的單層膜微氣泡（Microbubble）。如Figure1所示，通過(guò)磷脂質(zhì)的自組裝能力，磷脂層可以形成一個(gè)有效減緩氣體擴(kuò)散（Diffusion）的保護(hù)膜，避免微氣泡相互融合成更大的氣泡，并且在體內(nèi)穩(wěn)定循環(huán)，增強(qiáng)造影時(shí)間。磷脂質(zhì)殼層通常由2-3種磷脂質(zhì)組成；表面經(jīng)聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PET）修飾，避免了磷脂殼層之間相互團(tuán)聚，其生物相容性亦有提升。
圖1微泡結(jié)構(gòu)示意圖
1.2殼層成分
目前主流的超聲造影劑殼層材料均以磷脂質(zhì)為主，其優(yōu)勢(shì)在于磷脂質(zhì)可以形成良好彈性的單層膜，保護(hù)微氣泡能夠在超聲波發(fā)射中產(chǎn)生穩(wěn)定振動(dòng)，進(jìn)而表現(xiàn)出優(yōu)異的聲學(xué)特性，增強(qiáng)超聲成像效果。
1.3氣體成分分析
目前市售的超聲造影劑產(chǎn)品多采用全氟碳化合物。相對(duì)于空氣，全氟碳化合物具有較大的分子量、極低的水溶解度和緩慢的擴(kuò)散速率；因此全氟碳化合物穿透磷脂膜的理論能壘較高。全氟碳化合物可以有效減緩微泡泄氣速度，進(jìn)而增強(qiáng)微泡的造影時(shí)間。USphereTM所使用的氣體成分亦為全氟碳化物。
二、 競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品比較與優(yōu)勢(shì)分析
常見(jiàn)的商用動(dòng)物超聲微泡造影劑有美系的OptisonTM（GE Healthcare）、Definity® （Lantheus Medical Imaging）、歐系的 SonoVueTM（Braco）和日系的SonazoidTM（GE Healthcare）。常見(jiàn)的商用造影劑比較表如表1。
優(yōu)勢(shì)1．UsphereTM較其他產(chǎn)品具有非常優(yōu)異的粒徑分布（如圖2），它的微泡共振頻率更適合用于目前醫(yī)療儀器的范圍，大幅度提高超聲信號(hào)的強(qiáng)度。其次，良好的粒徑分布可以控制穩(wěn)定穴蝕（Stable Cavitation）及慣性穴蝕（Inertial Cavitation）所致的生物效應(yīng)，進(jìn)而降低其在檢測(cè)心血管疾病上的潛在風(fēng)險(xiǎn)和增強(qiáng)其在藥物遞送過(guò)程中的安全性。
優(yōu)勢(shì)2．UsphereTM系列產(chǎn)品粒徑更小，在提供更為細(xì)致的成像品質(zhì)的同時(shí)，仍保有在組織深部的回散射強(qiáng)度。
優(yōu)勢(shì)3．UsphereTM單位體積內(nèi)的微泡濃度可達(dá)2.5x1010Bubbles／mL，為同類產(chǎn)品中濃度較高者。由于其粒徑小、濃度高，對(duì)于腫瘤部位的血管造影更加明顯。
優(yōu)勢(shì)4．UsphereTM具有良好的穩(wěn)定與懸浮特性（如圖3），可以兼用作某些聲學(xué)研究（如超聲波場(chǎng)掃描與流體狀態(tài)分析）。
優(yōu)勢(shì)5．UsphereTM體內(nèi)循環(huán)時(shí)間高達(dá)6-15分鐘（如圖4），利于活體實(shí)驗(yàn)。開(kāi)封活化后三天可保持較高品質(zhì)，方便活體實(shí)驗(yàn)。而目前市*占有率較高的SonoVueTM僅有6小時(shí)的開(kāi)封后使用時(shí)間。
圖2USphereTM的物理表征：
電子顯微鏡圖（Cryo-TEM）
粒徑分布圖（Multisizer3，USPcompliant)
表1常見(jiàn)商用超聲造影及對(duì)比表
Table1 Comparisons of Commercialized ultra-sound contrast agents
| 品名 | 制造商 | 殼層 成分 | 氣體 成分 | 平均粒徑 (ur) | 粒徑低于10 μm微泡比例 | 微泡濃度 (particles/mL) | 使用時(shí)間 (Min) |
| OptisonTM | GE Healthcare Medical Diagnostics | 白蛋白（注：目前市 場(chǎng)已淘汰該技術(shù)） | C3F8 | 3.0-4.5 | 95% | 5.0-8.0x108 | 1-5 |
| Definity® | Lantheus Medical Imaging | 脂類／表面活性劑 | C3F8 | 1.1-3.3 | 98% | 1.2x1010 | 3.4-7.1 |
| SonoVueTM | Bracco Diagnostics | 脂類／表面活性劑 | SF6 | 20-3.0 | 99%(<11μm) | 0.9-6x109 | 3-6 |
| SonazoidTM | GE Healthcare Medical Diagnostics | 脂類 | C4F10 | 2.1 | 99.5% | 1.2x109 | 6-15 |
| UsphereTM | Trust Bio-sonics/United Well | 脂類／磷脂質(zhì) | C3F8 | 1.1-1.4 | >99.9% | 2.0-3.0x1010 | 6-15 |
圖3USphereTM在水溶液中的懸浮性圖片
Figure 3 USphereTM in aqueous suspension
圖4 USphereTM與SonoVueTM的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間比較。SonoVueTM 180s；USphereTM540s．
Figure 4. Comparison of in vivo circulation time with SonoVueTM
三、 產(chǎn)品種類與應(yīng)用
產(chǎn)品1．Prime
Prime是最基本的超聲造影劑類型，是針對(duì)小動(dòng)物超聲成像設(shè)計(jì)的最*微氣泡造影劑。由于其擁有粒徑小、濃度高、穩(wěn)定性佳的特性，且共振頻率覆蓋1-40MHz，適用于高解析度超聲設(shè)備（如Vevo2100，Braco系統(tǒng)等），以及大部分市售醫(yī)*超聲系統(tǒng)。Prime可以提供優(yōu)異的對(duì)比影像，在基礎(chǔ)研究中適用范圍廣泛。
Prime 最基本的應(yīng)用為檢測(cè)血液灌流（如圖5）、檢測(cè)微循環(huán)、輔助計(jì)算血流、心肌灌注等高靈敏度需求的診斷過(guò)程。使用微氣泡造影劑可提升深層組織的回散信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而有效延伸超聲波系統(tǒng)的成像深度。
圖5使用USphereTM小鼠腹部血液灌流檢測(cè)結(jié)果（Vevo2100小動(dòng)物超聲成像儀）
Figure 5. Detection of blood perfusion of the mice abdomen 其他延伸應(yīng)用包含：
(1) 心血管診斷
輔助觀察心室壁運(yùn)動(dòng)、心房或心室中膈缺損診斷、心肌缺血程度判斷與位置診斷、輔助冠心病診斷、氣球擴(kuò)張術(shù)評(píng)估、及術(shù)后血管再阻塞追蹤。
(2) 腫瘤診斷
腫瘤血液灌流（圖6）與腫瘤轉(zhuǎn)移診斷、乳癌檢測(cè)。
Figure 6 Mice tumor blood perfusion with Prime in Vevo 2100
新藥開(kāi)發(fā)、輔助肝硬化診斷、肝組織射頻燒灼術(shù)范圍偵測(cè)、超聲波系統(tǒng)演算法開(kāi)發(fā)。由于微泡可與超聲波協(xié)同作用后可刺激細(xì)胞增加通透性、促進(jìn)藥物釋放。微泡還可用于工業(yè)聲場(chǎng)量測(cè)量（acousticfield measurements）等。
產(chǎn)品2．Tracer
Tracer產(chǎn)品主要是在Prime上額外偶聯(lián)螢光物質(zhì)（fluorescent agent），使微氣泡除了可以用作超聲造影劑以外，亦可以應(yīng)用于熒光檢測(cè)。常見(jiàn)的用途包含：
(1) 藥物動(dòng)力學(xué)研究
將熒光物質(zhì)視為model drug，在熒光下觀察微氣泡的藥物動(dòng)力學(xué)。圖7為在小鼠window chamber模型下觀測(cè)Tracer隨血液動(dòng)力學(xué)與分布。
圖7在Window Chamber Model注射Tracer，觀察藥物動(dòng)力學(xué)
Figure 7 Pharmacokinetic Analysis of Tracer in Mice Window Chamber Model
(2) 超聲波驅(qū)動(dòng)藥物釋放監(jiān)測(cè)
同樣將熒光物質(zhì)視為model drug，配合超聲波的驅(qū)動(dòng)，觀察超聲波釋放微氣泡內(nèi)藥物的情形，亦可初步評(píng)估藥物治療情況。圖8為小鼠經(jīng)超聲波驅(qū)動(dòng)Tracer釋放螢光物質(zhì)后，以IVIS（PerkinElmer）系統(tǒng)顯示：右側(cè)施打超聲波的小鼠腿部有熒光訊號(hào)累積的現(xiàn)象。
圖8以IVIS追蹤超聲波驅(qū)動(dòng)藥物釋放
Figure 8 Ultrasound driven drug (tracer) delivery and release in vivo
(3) 細(xì)胞藥物釋放研究
于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究超聲波驅(qū)動(dòng)藥物釋放的情形（如圖9）。
圖9細(xì)胞中以超聲波驅(qū)動(dòng)Tracer釋放熒光物質(zhì)
Figure 9 Ultrasound driven drug (tracer) delivery and release in vitro
產(chǎn)品3．Deliver
Deliver 產(chǎn)品主要是在Prime上負(fù)載臨床上化*用藥doxorubicin（DOX）的載藥微氣泡，使微氣泡除了可作為超聲造影劑以外，同時(shí)可達(dá)到超聲波驅(qū)動(dòng)的藥物釋放和治療腫瘤的目的。Deliver較大優(yōu)勢(shì)在于注入活體內(nèi)后，能先利用微氣泡的顯影功能在超聲波影像上呈現(xiàn)腫瘤的位置，接著通過(guò)在目標(biāo)位置加強(qiáng)超聲波可驅(qū)動(dòng)Deliver內(nèi)藥物在靶向部位大量釋放，達(dá)到腫瘤局部化*的功效。圖10顯示骨肉瘤上利用Deliver的治療結(jié)果：，在治療后第五天可以利用超聲波顯影劑觀察到腫瘤出現(xiàn)壞死（necrosis）。
圖10左圖為Deliver的熒光顯微鏡圖像；右圖為利用超聲波驅(qū)動(dòng)Deliver釋放DOX進(jìn)行治療，可以觀察到在治療后第五天腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)壞死
Figure 10 Left:Fluorescence microscopy image of deliver; Right: Tumor necrosis on day 5 after injection of Deliver.Labeler產(chǎn)品則是在Prime的殼層上修飾生物*分子（biotin molecules］或卵白素（avidin），使用者能鍵結(jié)上抗體，使微氣泡具專一性吸附能力之能力，能針對(duì)特殊位置進(jìn)行專一性超聲波造影。圖11是在Labeler 上修飾anti-VEGFR2 antibody，可以觀察到微氣泡專一性的吸附于大量表達(dá)該抗體的癌細(xì)胞上。
圖11 在Labeler 上修飾 anti-VEGFR2 antibody，使微氣泡能大量且專一性的吸附于表達(dá)該抗體受體的癌細(xì)胞上
Figure 11 anti-VEGFR2 antibody labelled Labeler applied to targeting VEGF positive cancer cells產(chǎn)品5．Trans＋
Trans＋產(chǎn)品是在Prime的殼層材料上加入帶正電磷脂質(zhì)材料，使微氣泡殼層帶有正電，使用者能以簡(jiǎn)單的電性吸附原理，將帶負(fù)電的基因片段（DNA／RNA）吸附于微氣泡殼層上；再由超聲波驅(qū)動(dòng)達(dá)到基因遞送及基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）的功效。
圖12在Trans＋上吸附可以表達(dá)熒光的DNA，利用超聲波驅(qū)動(dòng)基因釋放與轉(zhuǎn)染后可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后的C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞均勻表達(dá)熒光
Figure 12 Full size Turbo Green absorbed Trans+ targeted to C6 glioma cells followed by the expression of turbo green
四、 目前已開(kāi)展的應(yīng)用研究
| 用途描述 |
| 豬左腳接肢后，以超聲波影像配合超聲造影劑觀察血流狀況，以確定接肢成功與否。 |
| 1．于小鼠腿部肌肉注射label有螢光的超聲造影劑，觀察微氣泡在肌肉組織的滯留時(shí)間與滯留范圍。2．基因轉(zhuǎn)殖細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察超聲波與超聲造影劑的cavitation dose。 |
| 于腫瘤動(dòng)物模型，靜脈注射超聲造影劑，配合超聲波觀察腫瘤狀態(tài)。 |
| 于豬肢進(jìn)行電燒后，靜脈注射超聲波對(duì)比劑，配合超聲波觀察電燒成功與否。 |
| 于微氣泡包覆藥物，配合超聲波進(jìn)行藥物遞送。 |
| 于肥胖大鼠上，靜脈注射超聲造影劑，配合超聲波進(jìn)行肥胖檢測(cè)。 |
| 靜脈注射超聲造影劑，配合超聲波，于肝癌模型進(jìn)行典型癌癥pattern分析。 |
| 將螢光接上微氣泡作為model drug，并將微氣泡水溶液由耳道滴于耳膜上，配合特殊超聲波，進(jìn)行藥物遞送（由耳膜遞送至中耳）。 |
| 以超聲造影劑配合超聲波，于細(xì)胞上進(jìn)行基因轉(zhuǎn)殖。 |
| 以超聲造影劑配合高頻超聲波，進(jìn)行高頻超聲波成像演算法開(kāi)發(fā)。 |
| 以超聲造影劑配合HIFU，進(jìn)行BBB-open，以及其后的藥物遞送和基因遞送。 |
| 于微氣泡包覆藥物，配合超聲波進(jìn)行藥物遞送。 |
| 1．以超聲造影劑配合聚焦式超聲波，進(jìn)行BBB-open，以及其后的藥物遞送和基因遞送。2．以超聲造影劑配合HIFU，于window-chamber模型進(jìn)行傷害性評(píng)估。3．以超聲造影劑配合聚焦式超聲波進(jìn)行物理參數(shù)與生物效應(yīng)評(píng)估。4．直接利用微氣泡作為MRI對(duì)比劑。5．以MRI觀測(cè)微氣泡與HIFU之作用。 |
| 作為顯影劑開(kāi)發(fā)的reference standard。 |
| 以超聲造影劑配合超聲波，進(jìn)行成像演算法開(kāi)發(fā)。 |
| 于小鼠肝癌模型，靜脈注射超聲造影劑，配合超聲波觀察腫瘤血流狀態(tài)，進(jìn)行新藥開(kāi)發(fā)。 |
| 以超聲造影劑配合超聲波，進(jìn)行動(dòng)態(tài)細(xì)胞sonoporation觀測(cè)。 |
| 于微氣泡包覆藥物，配合超聲波進(jìn)行藥物遞送。 |
| 利用微氣泡配合超聲波提升藥物輸送。 |
五、 文獻(xiàn)列表
1.S.T. Kang et al., "A Maleimide-Based In-Vitro Model for Ultrasound Targeted Imaging," Ultrasonics Sonochemistry, vol. 18, 2011.
2.C.H.Wang et al.,"Aptamer-Conjugated Nanobubbles for Targeted Ultrasound Molecular Imaging," Langmuir, vol. 27,2011.
3. S.T.Kang et al., "Intracellular Acoustic Droplet Vaporization in a Single Peritoneal Macrophage for Drug Delivery Applications,"Langmuir,vol.27,2011.
4.C.H.Wang et al., "Aptamer-Conjugated and Drug-Loaded Acoustic Droplets for Ultrasound Theranosis," Biomaterials, vol.33,2012.
5.S.T.Kang et al., "Ultrasound Microbubble Contrast Agents for Diagnostic and Therapeutic Applications: Current Status and Future Design," Chang Gung Medical Journal, vol. 35, 2012.
6.C.Y.Ting et al., "Concurrent Blood-Brain Barrier Opening and Local Drug Delivery Using Drug-Carrying Microbubbles and Focused Ultrasound for Brain Glioma Treatment," Biomaterials, vol. 33,2012.
7.P. Chonpathompikunlert et al., "Redox Nanoparticle Treatment Protects Against Neurological Deficit in Focused Ultrasound-Induced Intracerebral Hemorrhage," Nanomedicine, vol. 7,2012.
8.C. H. Fan et al., "Detection of Intracerebral Hemorrhage and Transient Blood-Supply Shortage in Focused-Ultrasound-Induced Blood-Brain-Barrier Disruption by Ultrasound Imaging," Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 38,2012.
9.C.H.Wang et al., "Superparamagnetic Iron Oxide and Drug Complex-Embedded Acoustic Droplets for Ultrasound Targeted Theranosis," Biomaterials, vol. 34, 2013.
10. C.H. Fan et al., "Antiangiogenic-Targeting Drug-Loaded Microbubbles Combined With Focused Ultrasound for Glioma Treatment," Biomaterials, vol.34, 2013.
11.C.H.Fan et al., "SPIO-Conjugated, Doxorubicin-Loaded Microbubbles for Concurrent MRI and Focused-Ultrasound Enhanced Brain-Tumor Drug Delivery," Biomaterials, vol. 34, 2013.
12.S.L.Peng et al., "Using Microbubbles as an MRI Contrast Agent for the Measurement of Cerebral Blood Volume," NMR in BioMedicine, doi: 10.1002/nbm.2988.NEW!
