標簽蛋白親和純化介質 Ni IDA Beads介紹

      Ni IDA Beads可以用于各種表達來源（如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞）的標簽（6xHis-tagged）蛋白的純化。它是以4%瓊脂糖凝膠為基質，通過化學方法偶聯了三配位的亞氨基二乙酸（IDA），螯合鎳離子（Ni2+）后，可以形成比較穩定的平面四邊形結構，從而有更多的位點與標簽上的咪唑環繼續配位，達到結合目的蛋白的效果。但是，這樣的結構比較容易受到其他小分子的進攻，鎳離子易被還原或者被螯合，從而破壞其化學結構，無法結合目的蛋白。Ni IDA Beads具有載量高，性能和價值匹配等優點。

表1. Ni IDA Beads產品性能

2.純化流程

2.1 緩沖液的準備

可使用下列推薦緩沖液，也可根據自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫。緩沖液在使用前盡量用0.22 μm 或者0.45 μm 濾膜過濾除菌。具體配置方法見表2。

2.2純化流程

2.2.1 細菌或酵母表達的蛋白

1）挑取單菌落到培養基中，根據載體使用說明，加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。

2）表達結束后，將培養液轉移到離心杯中，7，000 rpm（7，500×g），離心15min 收集菌體，然后按照菌體∶Lysis Buffer=1∶10（WNV）加入

Lysis Buffer，加入終濃度為 1mM的 PMSF。加入（工作濃度為 0.2-0.4 mg/ml，如果表達的宿主細胞內含 pLysS 或 pLysE，可以不加），同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結合）。

3）將菌體沉淀懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 μg/ml DNase I），混勻，放置于冰上，然后冰上超聲破

碎細胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉移至離心管中，10，000 rpm（15，000×g），4℃離心 20-30 min。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

2.2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白

1）將細胞培養液轉移至離心杯，5.000 rpm（3.800×g）;離心10min，收集菌體得上清，如上清中不含 EDTA、和還原劑等物質，即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、和還原劑等物質，需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。2）對于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.3 Ni IDA Beads 重力柱的裝填

1）取合適規格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關閉下出口。

2）將 Ni IDA Beads 混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質實際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護液。

3）加入適量純水沖洗介質，待柱管中液體重力流干后，關閉下出口。

4）裝入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡，暫不使用時則加入保護液，4-30℃保存。

2.4 樣品純化流程

2.4.1 孵育法純化

1）根據純化的樣品量，取適量 Ni IDA Beads加入離心管中，1000 rpm 離心 1min，吸棄上清;也可加入重力柱中，流干保護液。2）向離心管中加入5倍介質體積的Lysis Buffer 清洗介質，1000 rpm 離心1min，吸棄上清;如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干Lysis Buffer;重復兩次以上。

3）加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4℃振蕩孵育2-4 h 或者37℃孵育30 min-2 h。

4）孵育結束后，1000 rpm 離心1 min，吸棄上清，或過濾收集介質，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

5）用5倍介質體積的Wash Buffer 清洗介質，1000 rpm 離心 1min 或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到介質），重復3-5次，中間建議更換新離心管。必要時可以調整咪唑的濃度進行洗雜。

6）加入3-5倍柱體積的 Elution Buffer 進行洗脫，室溫孵育10-15 min，1000 rpm 離心1min 或重力柱管收集洗脫液，可重復2-3次。

2.4.2 重力柱法純化

1）將裝填好的 Ni IDA Beads 重力柱用5倍柱體積 Lysis Buffer 進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復 2-3次。

2）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時間至少2 min;保證樣品和介質充分接觸，收集流出液，可以反復上樣增加結合效率。

3）用 10-15倍柱體積的 Wash Buffer 進行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時可以調整咪唑的濃度進行洗雜。

4）使用5-10倍柱體積的 Elution Buffer 洗脫，分段收集，每一個柱體積收集一管，分別檢測，既可以保證所有結合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

上述步驟介質洗脫結束后，先用Lysis Buffer 沖洗3倍柱體積，然后用純水沖洗5倍柱體積，再用 20%乙醇沖洗2個柱體積，然后將介質置于2-8℃保存。2.5 SDS-PAGE 檢測

將使用純化產品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用 SDS-PAGE檢測純化效果。

3.在位清洗

當填料使用過程中發現反壓過高或者填料上面出現明顯的污染時，需要進行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。

建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過使用 30%異丙醇清洗 5-10個柱體積，接觸時間為 15-20 min 可以去除此類污染物。然后，再使用 10倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液，清洗填料 2倍柱體積。例如，含有0.1-0.5%非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液，接觸時間為 1-2 小時。去污劑處理后。需要使用70%的乙醇清洗5個柱體積。以徹切底去除去污劑。最后使用10倍柱體積的夫離子水清洗。

去除離子作用結合的蛋白 

使用 1.5M NaCI溶液清洗 10-15 min。然后，再使用去離子水清洗 10個柱體積。

4.填料再生

標簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使用過程中發現顏色變淺，或者填料載量明顯變低時，需要進行對填料進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內，按照下面操作流程進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

1）使用5倍柱體積去離子水清洗填料;

2）使用5倍柱體積100 mM EDTA（pH 8.0）剝落鎳離子;

3）使用10倍柱體積去離子水清洗填料;

4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積，停留 10-15min;

5）使用去離子水清洗填料，直至 pH中性;

6）使用 3-5倍柱體積 100 mM NiSO4再生掛鎳;

7）使用10倍柱體積去離子水清洗;

填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要將填料懸浮干等體積的 20%乙醇中，置于2-8°℃保存。

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