食品中大腸菌群和大腸桿菌的檢驗方法！
食品中大腸菌群和大腸桿菌的檢驗方法！
一、主題內(nèi)容與適用范圍
本文規(guī)定了食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法。
本文適用于航空食品的檢驗。
二、設備和材料
吸管（1ml、10ml）、恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均質(zhì)器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡等。
三、培養(yǎng)基和試劑
月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、EC肉湯、伊紅美藍瓊脂（EMB）、營養(yǎng)瓊脂斜面、*肉湯、MR-PV 培養(yǎng)基、Korser氏枸掾酸鹽肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液、生理鹽水、革蘭氏染色液、 Kovacs氏靛基質(zhì)試劑、甲基紅指示劑、Voges-proskauer（V-P）試劑。
四、樣品制備
⒈以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內(nèi)。如有包裝，則用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。
⒉制備樣品勻液
以無菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1-2min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質(zhì)時間超過2min，應在均質(zhì)杯外加冰水冷卻。
⒊稀釋樣品勻液
用10ml滅菌吸管準確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有90ml稀釋劑的150ml稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。
五、大腸菌群的測定
⒈大腸菌群MPN值的測定
⑴對每個樣品，選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯，每管接種1ml。
⑵將接種管置于36±1℃的培養(yǎng)48±2h。
⑶觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則進一步作證實試驗。
⒉大腸菌群的證實試驗
⑴將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。
⑵置BGLB肉湯管于36±1℃的培養(yǎng)48±2h。
⑶記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。
⑷結果報告：按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每克（毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。
六、糞大腸菌群測定
⒈用接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。
⒉將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入44.5±0.5℃水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h。水浴箱的水平面應高于肉湯培養(yǎng)基液面。應以已知為44.5℃產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和44.5℃不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性對照。
⒊記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陽性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陰性。
⒋結果報告：按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。
七、大腸桿菌測定
⒈將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍（EMB）平板，36±1℃的培養(yǎng)24±2h。
⒉檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
⒊如有典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，36±1℃的培養(yǎng)18-24h。
⒋將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基進行生化試驗。
⑴*肉湯：在36±1℃的培養(yǎng)24±2h后，加Kovacs氏試劑0.2-0.3ml，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應。
⑵MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃的培養(yǎng)48±2h后。以無菌操作移取培養(yǎng)物1ml至13mm*100mm試管中，加5%萘酚乙醇溶液0.6ml，40%氫氧化鉀溶液0.2ml和少許肌酸結晶，振搖試管后靜置2h，如出現(xiàn)伊紅色，為VP試驗陽性。
將 MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應。
⑶Korser氏枸掾酸鹽肉湯：于36±1℃的培養(yǎng)96h記錄有無生長。
⑷ LST肉湯：于36±1℃的培養(yǎng)48±2h，觀察試管中是否產(chǎn)氣。
⑸革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。
⑹大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下
如出現(xiàn)上表以外的生化反應類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試驗。
⒌結果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗為++--或-+--，再根據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表，報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。
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