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竹節香附素A 894
細胞培養操作規程：
一．培養基及培養凍存條件準備：
1）準備RPMI-1640培養基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優質胎牛血清，10%。
2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲存。
二．細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
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產品名稱 | CIK細胞 |
規格 | 1×10?Cells/T25培養瓶 |
分類 | 免疫細胞及干細胞 |
貨號 | GOY-01X1430 |
商品介紹：
名稱 CIK細胞 由于該細胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細胞（自然殺傷細胞）樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性，和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。該細胞對腫瘤細胞的識別能力很強，如同“細胞”，能精確“點射”腫瘤細胞，但不會傷及“無辜”的正常細胞。尤其對手術后或放化療后患者，能消除殘留微小的轉移病灶，防止癌細胞擴散和復發，提高機體免疫力，因此，CIK細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫治療的方案。 CIK細胞可以通過多機制抗腫瘤、抗病毒： 1.CIK細胞能以不同的機制識別腫瘤細胞，通過直接的細胞質顆粒穿透封閉的腫瘤細胞膜進行胞吐，釋放穿孔素、顆粒酶，實現對腫瘤細胞的裂解； 2.CIK細胞能分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6等多種炎性細胞因子，對腫瘤也有直接抑制作用； 3.CIK細胞可以通過配體-受體（Fas:FasL）介導的方式誘導腫瘤細胞凋亡，因此CIK尤其適用于FasL陽性腫瘤的治療； 4.CIK細胞分泌的細胞因子能顯著刺激初始型T細胞增殖，有效激活機體的免疫系統，使之趨于正常，提高病人自身抗腫瘤的能力。 目前，腫瘤的發生機制尚未形成普遍接受的理論。研究者普遍認可腫瘤的發生、發展與人體的免疫功能密切相關。即在正常情況下，腫瘤與機體的防御機能之間處于一種動態的平衡，而一旦這種平衡被破壞，就可能發生腫瘤。身體各組織細胞受到外界化學、物理、生物等因素刺激或自身細胞衰老變異等因素的影響，使得體內某些細胞發生突變，成為癌前細胞；而機體免疫功能低下或者由于免疫異常，無法及時識別、殺傷、清除這些異常細胞，突變細胞在組織內復制生長，達到一定數量后破壞器官功能，腫瘤即發生。腫瘤患者，尤其是惡性腫瘤病人往往免疫功能、特別是細胞免疫功能低下，因而疾病呈進展、活動、預后差。因此，提高機體免疫力，建立有效的免疫應答是治療腫瘤最有希望的途徑。CIK細胞治療即將大量殺傷性高、功能強、數量多的免疫活性細胞回輸患者體內，直接發揮殺死腫瘤細胞的作用，并通過調節、激活患者的免疫體系，調動、提高患者自身的抗腫瘤能力。 CIK細胞具有以下突出的特點： 1.增殖速度快，殺瘤活性高。CIK細胞可以在體外大量擴增，培養14天可以增殖200倍以上，其效應細胞CD3+CD56+的增殖可達1000倍以上，抗腫瘤活性得以大大增強。 2.殺瘤譜廣。CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷是非MHC限制的，對多種腫瘤細胞均有殺滅作用。 3.能抵抗腫瘤細胞引發的效應細胞Fas-FasL凋亡。CIK細胞雖然在Fas被占據后會引起少量細胞凋亡，但對其殺瘤細胞毒性沒有明顯影響；反之，CIK細胞可以誘導FasL陽性腫瘤細胞的凋亡。 4.對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感。CIK細胞對放、化療敏感的親本細胞和不敏感的轉化細胞均具有強大的殺傷活性。 5.CIK細胞殺瘤活性不受CsA（A）和FK506（普樂可復）等免疫抑制劑的影響。 6.對正常骨髓造血前體細胞毒性小，僅對紅系生成產生輕微的抑制，這可能與CIK細胞自身分泌高水平的IFN-γ有關。 7.CIK細胞具有識別腫瘤的機制，特異性強，對正常的細胞無毒性作用。 8.安全性好。CIK細胞是活化的患者自體細胞，應用安全，不會產生排斥等反應，患者副反應小。 |
使用方法：
收到細胞后，請按照以下方法進行操作。
1. 取出25cm2培養瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩定細胞狀態。
2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養。
3. 細胞傳代
1) 吸出25cm2培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；
2) 添加0.125%消化液約1mL至培養瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養液終止消化；
3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的*培養基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中培養；
4) 待細胞*貼壁后，培養觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養基。
培養操作：
1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培 養過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養基，培養過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養。
1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于 37℃培 養箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養 瓶后加少量培養基終止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養液后吹勻。
4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；
1. 細胞凍存時，棄去培養基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養基終止消化，可使用血球計數板計數。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細胞，根據細胞數量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液，注意凍 存管做好標識。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
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